Kea leboha ha u etetse Nature.com.Mofuta oa sebatli oo u o sebelisang o na le tšehetso e fokolang ea CSS.Bakeng sa boiphihlelo bo botle ka ho fetesisa, re khothaletsa hore o sebelise sebatli se ntlafalitsoeng (kapa o tima Compatibility Mode ho Internet Explorer).Khabareng, ho netefatsa ts'ehetso e tsoelang pele, re tla fana ka sebaka sa marang-rang ntle le mekhoa le JavaScript.
Li-vector tsa liphatsa tsa lefutso bakeng sa phekolo ea pulmonary cystic fibrosis li tlameha ho lebisoa ho li-airways tse tsamaisang, kaha phetisetso ea matšoafo ea peripheral ha e na phello ea phekolo.Ho sebetsa hantle ha kokoana-hloko ho amana ka ho toba le nako ea ho lula ha mojari.Leha ho le joalo, maro a ho pepa a kang liphatsa tsa lefutso ka tlhaho a hasana ho alveoli nakong ea ho hema, 'me likaroloana tsa phekolo tsa sebopeho leha e le sefe li tlosoa ka potlako ke lipalangoang tsa mucociliary.Ho eketsa nako ea ho lula ha liphatsa tsa lefutso ka har'a pampitšana ea phefumoloho ke habohlokoa empa ho thata ho e finyella.Likaroloana tsa makenete tse kopantsoeng le Carrier-conjugated tse ka lebisoang holim'a pampiri ea phefumoloho li ka ntlafatsa sepheo sa libaka.Ka lebaka la mathata a in vivo imaging, boitšoaro ba likaroloana tse nyane joalo tsa makenete sebakeng sa moea ka pel'a matla a khoheli a sebelisitsoeng ha bo utloisisoe hantle.Sepheo sa thuto ena e ne e le ho sebelisa litšoantšo tsa synchrotron ho bona ka mahlo a kelello ho sisinyeha ha letoto la likaroloana tsa makenete ka har'a trachea ea likhoto tse nang le anesthetized e le ho ithuta matla le mekhoa ea boitšoaro ea likaroloana tse le 'ngoe le tse ngata ka har'a vivo.Ka mor'a moo re ile ra hlahloba hore na ho fana ka likaroloana tsa magnetic lentiviral ka pel'a matla a khoheli ho ka eketsa katleho ea transduction ho trachea ea rat.Sets'oants'o sa X-ray sa Synchrotron se bonts'a boits'oaro ba likaroloana tsa makenete libakeng tse emeng le tse tsamaeang tse tsamaeang ka har'a vitro le vivo.Li-particle ha li khone ho huloa habonolo holim'a litsela tse phelang tsa moea li sebelisa li-magnets, empa nakong ea lipalangoang, li-deposit li tsepamisitsoe sebakeng sa pono, moo matla a khoheli a leng matla ka ho fetisisa.Bokhoni ba ho fetisoa le bona bo ile ba eketseha ka makhetlo a tšeletseng ha likaroloana tsa makenete ea lentiviral li ne li fanoa ka pel'a matla a khoheli.Ha li kopane, liphetho tsena li fana ka maikutlo a hore likaroloana tsa makenete tsa lentiviral le matla a khoheli e kanna ea ba mekhoa ea bohlokoa ea ho ntlafatsa tsepamiso ea liphatsa tsa lefutso le maemo a transduction litseleng tsa moea tse tsamaisang moea ka har'a vivo.
Cystic fibrosis (CF) e bakoa ke ho fapana ha gene e le 'ngoe e bitsoang CF transmembrane conductance regulator (CFTR).Protheine ea CFTR ke mocha oa ion o teng liseleng tse ngata tsa epithelial ho pholletsa le 'mele, ho kenyeletsa le litsela tsa moea, sebaka se seholo sa pathogenesis ea cystic fibrosis.Mefokolo ho CFTR e lebisa ho lipalangoang tse sa tloaelehang tsa metsi, ho felloa ke metsi 'meleng oa sebaka sa moea, le ho fokotseha ha botebo ba mokelikeli oa moea (ASL).E boetse e senya bokhoni ba tsamaiso ea lipalangoang tsa mucociliary (MCT) ho hlakola litsela tsa moea tsa likaroloana tse hulelitsoeng le likokoana-hloko.Sepheo sa rona ke ho hlahisa phekolo ea liphatsa tsa lefutso tsa lentiviral (LV) ho fana ka kopi e nepahetseng ea lefutso la CFTR le ho ntlafatsa ASL, MCT, le bophelo bo botle ba matšoafo, le ho tsoela pele ho hlahisa mekhoa e mecha e ka methang liparamente tsena ka vivo1.
Li-vector tsa LV ke tse ling tsa batho ba itlhommeng pele bakeng sa cystic fibrosis gene therapy, haholo hobane ba ka kopanya ka ho sa feleng mofuta oa kalafo ho lisele tsa moea (airway stem cell).Sena ke sa bohlokoa hobane ba ka khutlisa metsi a tloaelehileng le "mucus clearance" ka ho arola lisele tsa moea tse sebetsanang le liphatsa tsa lefutso tse amanang le cystic fibrosis, tse hlahisang melemo ea bophelo bohle.Li-vector tsa LV li tlameha ho lebisoa khahlano le litselana tse tsamaisang moea, kaha ke hona moo ho ameha ha matšoafo ho CF ho qalang.Ho fetisoa ha vector ka hare ho matšoafo ho ka 'na ha fella ka phetoho ea alveolar, empa sena ha se na phello ea phekolo ho cystic fibrosis.Leha ho le joalo, metsi a kang liphatsa tsa lefutso ka tlhaho a fallela alveoli ha a hema ka mor'a ho beleha3,4 'me likaroloana tsa phekolo li lelekoa ka potlako ka har'a molomo oa molomo ke MCTs.Ho sebetsa hantle ha phetoho ea LV ho amana ka ho toba le bolelele ba nako eo vector e lulang e le haufi le lisele tse lebisitsoeng ho lumella ho kenngoa ha lisele - "nako ea bolulo" 5 e khutsufatsoang habonolo ke moea o tloaelehileng oa sebaka sa moea hammoho le ho kenngoa ho hokahaneng ha li-mucus le likaroloana tsa MCT.Bakeng sa cystic fibrosis, bokhoni ba ho lelefatsa nako ea ho lula ha LV moeeng ke habohlokoa ho finyella maemo a phahameng a phetisetso sebakeng sena, empa ho fihlela joale e bile phephetso.
Ho hlola bothata bona, re sisinya hore LV magnetic particles (MPs) e ka thusa ka litsela tse peli tse tlatsanang.Taba ea pele, li ka tataisoa ke makenete sebakeng sa moea ho ntlafatsa sepheo le ho thusa likaroloana tse tsamaisang liphatsa tsa lefutso ho ba sebakeng se nepahetseng sa tsela ea moea;le ASL) li fetela ka har'a lisele tsa 6. Litho tsa MP li sebelisoa haholo e le likoloi tsa ho tsamaisa lithethefatsi tse lebisitsoeng ha li tlama li-antibodies, lithethefatsi tsa chemotherapy, kapa limolek'hule tse ling tse nyenyane tse khomarelang lera la sele kapa li tlama ho li-receptor tsa tsona tse fapaneng 'me li ipokellela libakeng tsa hlahala. boteng ba motlakase o tsitsitseng.Libaka tsa Magnetic bakeng sa phekolo ea kankere 7. Mekhoa e meng ea "hyperthermic" e reretsoe ho bolaea lisele tsa hlahala ka ho futhumatsa litho tsa MP ha li pepesehetse matla a khoheli a oscillating.Molao-motheo oa phetisetso ea makenete, oo matla a khoheli a sebelisoang e le sesebelisoa sa phetisetso ho matlafatsa phetisetso ea DNA liseleng, hangata o sebelisoa in vitro ho sebelisoa mefuta e mengata ea liphatsa tsa lefutso tse se nang kokoana-hloko le kokoana bakeng sa mela e thata ho fetisa lisele. ..Ho ile ha thehoa bokhoni ba LV magnetotransfection ka ho fana ka LV MP in vitro mohala oa sele ea bronchial epithelium ka pel'a matla a khoheli a tsitsitseng, ho eketsa katleho ea phetisetso ka makhetlo a 186 ha ho bapisoa le vector ea LV feela.LV MT e boetse e sebelisitsoe ho mofuta oa in vitro oa cystic fibrosis, moo phetisetso ea makenete e ileng ea eketsa phetisetso ea LV ho litloaelo tsa sebopeho sa mokelikeli oa moea ka karolo ea 20 boteng ba cystic fibrosis sputum10.Leha ho le joalo, in vivo organ magnetotransfection e fumane tlhokomelo e batlang e fokola 'me e hlahlobiloe feela lithutong tse seng kae tsa liphoofolo11,12,13,14,15, haholo-holo matšoafo16,17.Leha ho le joalo, menyetla ea phetisetso ea makenete kalafong ea matšoafo ho cystic fibrosis e hlakile.Tan et al.(2020) e boletse hore "thuto ea netefatso mabapi le phano e sebetsang ea pulmonary ea li-magnetic nanoparticles e tla bula tsela bakeng sa maano a nakong e tlang a CFTR a ho inhalation ho ntlafatsa sephetho sa kliniki ho bakuli ba nang le cystic fibrosis"6.
Boitšoaro ba likaroloana tse nyane tsa makenete holim'a mokokotlo oa phefumoloho ka pel'a matla a khoheli a sebelisitsoeng ho thata ho bona le ho ithuta, ka hona ha li utloisisoe hantle.Lithutong tse ling, re thehile mokhoa oa Synchrotron Propagation Based Phase Contrast X-Ray Imaging (PB-PCXI) bakeng sa ho nahana ka mokhoa o sa hlaseleng le palo ea liphetoho tsa motsotso ka har'a vivo botebong ba ASL18 le boits'oaro ba MCT19,20 ho lekanya ka kotloloho metsi a phallo ea khase. 'me e sebelisoa e le sesupo sa katleho ea kalafo ea pele.Ho feta moo, mokhoa oa rona oa ho fumana lintlha oa MCT o sebelisa likaroloana tsa bophara ba 10-35 µm tse entsoeng ka alumina kapa khalase e phahameng ea refractive e le matšoao a MCT a bonahalang ka PB-PCXI21.Mekhoa ena ka bobeli e loketse ho nka mefuta e mengata ea likaroloana, ho kenyeletsoa le MP.
Ka lebaka la tharollo e phahameng ea sebaka le ea nakoana, liteko tsa rona tsa ASL le MCT tse thehiloeng ho PB-PCXI li loketse hantle ho ithuta ka matla le mekhoa ea boitšoaro ea likaroloana tse le 'ngoe le tse ngata ka har'a vivo ho re thusa ho utloisisa le ho ntlafatsa mekhoa ea phepelo ea liphatsa tsa lefutso tsa MP.Mokhoa oo re o sebelisang mona o ipapisitse le lithuto tsa rona re sebelisa mohala oa SPring-8 BL20B2, moo re boneng ho sisinyeha ha mokelikeli kamora ho tlisoa ha lethal dose ea dummy vector ho litoeba tsa nko le pulmonary ho thusa ho hlalosa mekhoa ea rona ea liphatsa tsa lefutso tse bonoang. lefutsong la rona.lithuto tsa liphoofolo ka lethal dose ea 3.4.
Sepheo sa thuto ena e ne e le ho sebelisa synchrotron ea PB-PCXI ho bona ka mahlo a kelello metsamao ea li-MP ka har'a trachea ea likhoto tse phelang.Lithuto tsena tsa litšoantšo tsa PB-PCXI li ne li etselitsoe ho leka letoto la MP, matla a matla a matla a khoheli, le sebaka ho fumana phello ea bona ho motsamao oa MP.Re ne re nahana hore matla a khoheli a kantle a tla thusa MF ho lula kapa ho fallela sebakeng seo ho shebiloeng ho sona.Lithuto tsena li boetse li re lumelletse ho tseba meralo ea makenete e eketsang palo ea likaroloana tse setseng ho trachea kamora ho beoa.Letotong la bobeli la lithuto, re ne re ikemiselitse ho sebelisa tlhophiso ena e nepahetseng ho bonts'a mokhoa oa phetisetso o bakoang ke ho fana ka li-LV-MPs ho li-rat airways, ka maikutlo a hore ho tsamaisoa ha li-LV-MP maemong a sepheo sa moea ho tla fella. ka katleho e eketsehileng ea phetisetso ea LV..
Lithuto tsohle tsa liphoofolo li entsoe ho latela melaoana e amohetsoeng ke Univesithi ea Adelaide (M-2019-060 le M-2020-022) le Komiti ea Boitšoaro ea Liphoofolo ea SPring-8 Synchrotron.Liteko li entsoe ho latela likhothaletso tsa ARRIVE.
Litšoantšo tsohle tsa x-ray li nkiloe lebaleng la BL20XU ho SPring-8 synchrotron Japane ho sebelisoa setup se tšoanang le se hlalositsoeng pele21,22.Ka bokhutšoanyane, lebokose la liteko le ne le fumaneha 245 m ho tloha lesale la polokelo la synchrotron.Sehole sa sampole ho isa ho detector sa 0.6 m se sebelisoa bakeng sa boithuto ba ho nahana ka likaroloana le 0.3 m bakeng sa lithuto tsa in vivo imaging ho theha litlamorao tsa phapano.Ho ile ha sebelisoa lebone la monochromatic le matla a 25 keV.Litšoantšo li ile tsa fumanoa ho sebelisoa mochine oa X-ray transducer (SPring-8 BM3) o kopantsoeng le mochine oa sCMOS.Transducer e fetola mahlaseli a X-ray ho leseli le bonahalang a sebelisa 10 µm thick scintillator (Gd3Al2Ga3O12), e ntan'o lebisoa ho sensor ea sCMOS e sebelisa sepheo sa × 10 (NA 0.3) microscope.Sesebelisoa sa sCMOS e ne e le Orca-Flash4.0 (Hamamatsu Photonics, Japan) e nang le boholo ba lipikselse tse 2048 × 2048 le saese e tala ea pixel ea 6.5 × 6.5 µm.Tlhophiso ena e fana ka boholo bo sebetsang ba pixel ea isotropic ea 0.51 µm le sebaka sa pono sa hoo e ka bang 1.1 mm × 1.1 mm.Nako ea ho pepeseha ea 100 ms e khethiloe ho eketsa tekanyo ea pontšo-ho-lerata ea likaroloana tsa makenete ka hare le ka ntle ho litsela tsa moea ha ho ntse ho fokotsa lintho tse entsoeng ka letsoho tse bakoang ke ho hema.Bakeng sa lithuto tsa vivo, shutter e potlakileng ea X-ray e ile ea behoa tseleng ea X-ray ho fokotsa tekanyo ea mahlaseli ka ho thibela mahlaseli a X-ray pakeng tsa ho pepeseha.
Mecha ea litaba ea LV ha ea ka ea sebelisoa lithutong life kapa life tsa litšoantšo tsa SPring-8 PB-PCXI hobane kamore ea ho nka litšoantšo ea BL20XU ha e netefatsoe ka Biosafety Level 2.Ho e-na le hoo, re ile ra khetha mefuta e mengata ea litho tsa MP tse nang le mekhoa e metle ho tsoa ho barekisi ba babeli ba khoebo ba koahelang mefuta e mengata ea boholo, lisebelisoa, likhahla tsa tšepe le lisebelisoa, - pele e le ho utloisisa hore na matla a khoheli a ama joang ho tsamaea ha litho tsa MP ka li-capillaries tsa khalase, ebe litsela tse phelang tsa moea.bokahodimo.Boholo ba MP bo fapana ho tloha ho 0.25 ho isa ho 18 µm mme bo entsoe ka lisebelisoa tse fapaneng (sheba Lethathamo la 1), empa sebopeho sa sampole ka 'ngoe, ho kenyeletsoa boholo ba likaroloana tsa makenete ho MP, ha li tsejoe.Ho ipapisitsoe le lithuto tsa rona tse pharalletseng tsa MCT 19, 20, 21, 23, 24, re lebelletse hore MP ho fihla ho 5 µm e ka bonoa holim'a tracheal airway, mohlala, ka ho tlosa liforeimi tse latellanang ho bona ponahalo e ntlafalitsoeng ea motsamao oa MP.MP e le 'ngoe ea 0.25 µm e nyane ho feta tharollo ea sesebelisoa sa ho nka litšoantšo, empa PB-PCXI e lebelletsoe ho bona phapang ea bona ea volumetric le motsamao oa mokelikeli o holim'a metsi oo li kentsoeng ho ona ka mor'a hore li behoe.
Mehlala ea MP ka 'ngoe e tafoleng.1 e ne e lokiselitsoe ka 20 μl li-capillaries tsa khalase (Drummond Microcaps, PA, USA) ka bophara ba ka hare ba 0.63 mm.Likaroloana tsa Corpuscular li fumaneha ka metsing, ha likaroloana tsa CombiMag li fumaneha ka har'a mokelikeli oa moetsi.Tube e 'ngoe le e 'ngoe e tlatsitsoe ka metsi (hoo e ka bang 11 µl) ebe e behoa holim'a sets'oants'o sa mohlala (sheba setšoantšo sa 1).Li-capillaries tsa khalase li ne li behiloe ka holimo sethaleng ka kamoreng ea litšoantšo, ka ho latellana, 'me li behiloe metseng ea mokelikeli.A 19 mm bophara (28 mm bolelele) makenete ea khetla ea nickel e entsoeng ka lefatše le sa tloaelehang, neodymium, tšepe le boron (NdFeB) (N35, cat. no. LM1652, Jaycar Electronics, Australia) e nang le remanence ea 1.17 T e ne e khomaretsoe arola tafole ea phetisetso ho fihlela Remoutu fetola boemo ba hau nakong ea ho fana.Ho nka litšoantšo tsa X-ray ho qala ha makenete e behiloe hoo e ka bang 30 mm ka holim'a sampole 'me litšoantšo li fumanoa liforeimi tse 4 motsotsoana.Nakong ea ho nka litšoantšo, makenete e ile ea atametsoa haufi le khalase ea capillary tube (bohole ba hoo e ka bang 1 mm) ebe e tsamaea haufi le tube ho hlahloba phello ea matla a tšimo le boemo.
Setšoantšo sa in vitro imaging se nang le lisampole tsa MP ka har'a li-capillari tsa khalase nakong ea phetolelo ea sampole ea xy.Tsela ea sefate sa X-ray e tšoailoe ka mola o matheba o mofubelu.
Hang ha ponahalo ea in vitro ea MP e thehiloe, karoloana ea bona e ile ea lekoa ka har'a likhoto tsa mofuta o hlaha tsa Wistar albino (~ libeke tse 12, ~ 200 g).Medetomidine 0.24 mg/kg (Domitor®, Zenoaq, Japan), midazolam 3.2 mg/kg (Dormicum®, Astellas Pharma, Japan) le butorphanol 4 mg/kg (Vetorphale®, Meiji Seika).Likhoto li ne li tšeloa ka motsoako oa Pharma (Japan) ka ente ea intraperitoneal.Ka mor'a anesthesia, ba ne ba lokiselitsoe ho nka litšoantšo ka ho tlosa boea bo pota-potileng trachea, ho kenya endotracheal tube (ET; 16 Ga intravenous cannula, Terumo BCT), le ho ba thibela ho ba boemong ba supine holim'a poleiti ea litšoantšo e entsoeng ka tloaelo e nang le mokotla o chesang. ho boloka mocheso wa mmele.22. Joale poleiti ea litšoantšo e ne e khomaretsoe sethaleng sa sampuli lebokoseng la litšoantšo ka lehlakoreng le lenyenyane ho lumellana le trachea ka mokhoa o holimo setšoantšong sa x-ray joalokaha ho bontšitsoe setšoantšong sa 2a.
(a) In vivo imaging setup yuniti ea ho nka litšoantšo ea SPring-8, tsela ea X-ray e tšoailoeng ka matheba a mafubelu.(b,c) Tracheal magnet localization e ne e etsoa hole ho sebelisoa lik'hamera tse peli tsa IP tse kentsoeng ka orthogonally.Ka lehlakoreng le letšehali la setšoantšo se skrineng, u ka bona mohala oa mohala o tšoereng hlooho le cannula ea ho fana e kentsoeng ka har'a ET tube.
Sistimi ea pompo ea seringe e laoloang hole (UMP2, World Precision Instruments, Sarasota, FL) e sebelisang serinji ea khalase ea 100 µl e ne e hokahantsoe le PE10 tubing (0.61 mm OD, 0.28 mm ID) e sebelisa nale ea 30 Ga.Tšoaea tube ho etsa bonnete ba hore ntlha e boemong bo nepahetseng trachea ha u kenya endotracheal tube.Ho sebelisoa micropump, syringe plunger e ile ea ntšoa 'me ntlha ea tube e ile ea qoelisoa ka har'a sampole ea MP e lokelang ho tsamaisoa.Ka mor'a moo, tube ea phano e laetsoeng e ile ea kenngoa ka har'a endotracheal tube, e beha ntlha karolong e matla ka ho fetisisa ea matla a rona a khoheli a neng a lebeletsoe.Ho nkuoa ha setšoantšo ho ne ho laoloa ho sebelisoa mochine oa moea o hokahantsoeng le lebokoseng la rona la nako le thehiloeng ho Arduino, 'me mats'oao ohle (mohlala, mocheso, phefumoloho, ho buloa / ho koala ha sets'oants'o, le ho nkuoa ha litšoantšo) a tlalehiloe ho sebelisoa Powerlab le LabChart (AD Instruments, Sydney, Australia) 22 Ha ho Nahana Ha ntlo e ne e sa fumanehe, lik'hamera tse peli tsa IP (Panasonic BB-SC382) li ne li behiloe hoo e ka bang 90 ° ho tse ling 'me li sebelisetsoa ho laola boemo ba makenete e amanang le trachea nakong ea litšoantšo (Setšoantšo sa 2b, c).Ho fokotsa lintho tse entsoeng ka matsoho, ho ile ha fumanoa setšoantšo se le seng ka phefumoloho e 'ngoe le e 'ngoe nakong ea sehlaba sa phefumoloho ea phefumoloho.
Makenete e khomaretsoe mothating oa bobeli, o ka bang teng hole ka ntle ho 'mele oa litšoantšo.Maemo a fapaneng le litlhophiso tsa makenete li ile tsa lekoa, ho kenyelletsa: ho behiloe ka lehlakoreng la hoo e ka bang 30 ° ka holim'a trachea (litlhophiso li bontšoa ho Figures 2a le 3a);makenete e 'ngoe ka holim'a phoofolo 'me e' ngoe e ka tlase, e nang le lipalo tse behiloeng bakeng sa ho hohela (Setšoantšo sa 3b)., makenete e le 'ngoe ka holim'a phoofolo le e' ngoe e ka tlaase, e nang le lipalo tse behiloeng bakeng sa ho repulsion (Figure 3c), le makenete e le 'ngoe ka holimo le perpendicular ho trachea (Figure 3d).Kamora ho seta phoofolo le makenete le ho kenya MP tlasa teko pompong ea seringe, fana ka tekanyo ea 50 µl ka sekhahla sa 4 µl/sec ha u fumana litšoantšo.Joale makenete e suthisoa pele le pele hammoho kapa ka mose ho trachea ha e ntse e tsoela pele ho fumana litšoantšo.
Tlhophiso ea Magnet bakeng sa setšoantšo sa in vivo (a) makenete a le mong ka holim'a trachea ka lehlakoreng la hoo e ka bang 30 °, (b) limakete tse peli tse etselitsoeng ho hohela, (c) limakete tse peli tse etselitsoeng ho kheloha, (d) makenete e le 'ngoe ka holimo le e lumellanang le trachea.Moshebelli o ile a sheba fatše ho tloha molomong ho ea matšoafong ka trachea 'me lehlaseli la X-ray la feta ka lehlakoreng le letšehali la rat 'me la tsoa ka lehlakoreng le letona.Makenete e ka isoa bolelele ba tsela ea moea kapa ka ho le letšehali le ka holim'a trachea ho ea ka lebaleng la X-ray.
Re ile ra boela ra batla ho tseba ponahalo le boitšoaro ba likaroloana tse moeeng ha ho se na motsoako oa ho hema le ho otla ha pelo.Ka hona, qetellong ea nako ea litšoantšo, liphoofolo li ile tsa bolaoa ka botho ka lebaka la overdose ea pentobarbital (Somnopentyl, Pitman-Moore, Washington Crossing, USA; ~ 65 mg / kg ip).Liphoofolo tse ling li ile tsa siuoa sethaleng sa litšoantšo, 'me ka mor'a ho khaotsa ho phefumoloha le ho otla ha pelo, mokhoa oa ho nka litšoantšo o ile oa phetoa, ho eketsa tekanyo e eketsehileng ea MP haeba ho se MP e bonahalang holim'a moea.
Litšoantšo tse hlahisitsoeng li ile tsa lokisoa bakeng sa lebala le bataletseng le le lefifi 'me tsa bokelloa filiming (liforeimi tse 20 motsotsoana; 15–25 × lebelo le tloaelehileng ho latela sekhahla sa ho hema) ho sebelisoa mongolo o tloaelehileng o ngotsoeng ho MATLAB (R2020a, The Mathworks).
Lithuto tsohle tse mabapi le phano ea liphatlalatso tsa liphatsa tsa lefutso tsa LV li entsoe Univesithing ea Adelaide Laboratory Animal Research Center 'me li ne li reretsoe ho sebelisa liphetho tsa liteko tsa SPring-8 ho lekola hore na phano ea LV-MP boteng ba matla a khoheli e ka ntlafatsa phetiso ea lefutso ka har'a vivo. .Ho hlahloba liphello tsa MF le matla a khoheli, lihlopha tse peli tsa liphoofolo li ile tsa phekoloa: sehlopha se le seng se ne se entoa ka LV MF ka ho behoa ha makenete, 'me sehlopha se seng se ne se kenngoa ka sehlopha sa taolo se nang le LV MF ntle le makenete.
Li-vector tsa liphatsa tsa lefutso tsa LV li hlahisitsoe ho sebelisoa mekhoa e hlalositsoeng pele 25, 26 .Vector ea LacZ e hlahisa mofuta oa nyutlelie oa beta-galactosidase oa nyutlelie o tsamaisoang ke MPSV constitutive promoter (LV-LacZ), e hlahisang sehlahisoa sa karabelo e putsoa liseleng tse fetotsoeng, tse bonoang mahlakoreng le likarolong tsa lisele tsa matšoafo.Titration e ne e etsoa litloaelong tsa lisele ka ho bala ka letsoho palo ea lisele tse ntle tsa LacZ ho sebelisa hemocytometer ho bala titer ho TU / ml.Li-carriers li cryopreserved ho -80 ° C, lia qhibiliha pele li sebelisoa, 'me li tlamisoa ho CombiMag ka ho kopanya 1: 1 le ho kenya leqhoa bonyane metsotso e 30 pele ho tsoalo.
Likhoto tse tloaelehileng tsa Sprague Dawley (n = 3 / sehlopha, ~ 2-3 anesthetized ip e nang le motsoako oa 0.4mg / kg medetomidine (Domitor, Ilium, Australia) le 60mg / kg ketamine (Ilium, Australia) ka 1 khoeli ea lilemo) ip ) ente le cannula ea molomo e sa buuoeng ka 16 Ga intravenous cannula.Ho etsa bonnete ba hore lisele tsa tracheal airway li fumana phetisetso ea LV, e ne e sebelisoa ho sebelisa protocol ea rona e neng e hlalositsoe nakong e fetileng ea ho ferekanngoa ha sefofane moo tracheal airway surface e neng e phunyeletsoa axially ka basketeng ea terata (N-Circle, nitinol stone extractor ntle le ntlha NTSE-022115 ) -UDH , Cook Medical, USA) 30 p28.Joale, metsotso e ka bang 10 ka mor'a pherekano ka har'a khabinete ea biosafety, tsamaiso ea tracheal ea LV-MP e ile ea etsoa.
Matla a khoheli a sebelisitsoeng tekong ena a entsoe ka mokhoa o ts'oanang le boithuto ba x-ray ba in vivo, ka limakete tse ts'oanang tse ts'oeroeng holim'a trachea ka li-clamp tsa distillation stent (Setšoantšo sa 4).Molumo oa 50 µl (2 x 25 µl aliquots) oa LV-MP o ile oa isoa trachea (n = liphoofolo tse 3) ho sebelisoa pipette e nang le gel-tipped joalokaha ho hlalositsoe pejana.Sehlopha sa taolo (n = liphoofolo tse 3) se amohetse LV-MP e tšoanang ntle le tšebeliso ea makenete.Ka mor'a ho phethoa ha infusion, cannula e tlosoa ka har'a tube ea endotracheal 'me phoofolo e ntšoa.Makenete e lula sebakeng sa metsotso e 10 pele e tlosoa.Likhoto li ne li tšeloa ka tlas'a meloxicam (1 ml / kg) (Ilium, Australia) e lateloa ke ho tlosoa ha anesthesia ka ente ea intraperitoneal ea 1 mg / kg atipamazole hydrochloride (Antisedan, Zoetis, Australia).Likhoto li ne li lula li futhumetse 'me li hlokomeloa ho fihlela li hlaphoheloa ka ho feletseng ho tloha ho anesthesia.
Sesebelisoa sa ho fana ka LV-MP ka har'a khabinete ea polokeho ea baeloji.U ka bona hore lesela le khanyang la Luer-lock la ET tube le tsoa molomong, 'me ntlha ea pipette ea gel e bontšitsoeng setšoantšong e kenngoa ka ET tube ho ea botebo bo batlang ka har'a trachea.
Beke e le 'ngoe ka mor'a ts'ebetso ea tsamaiso ea LV-MP, liphoofolo li ile tsa etsoa sehlabelo ka botho ka ho hema 100% CO2 le polelo ea LacZ e ile ea hlahlojoa ho sebelisoa phekolo ea rona e tloaelehileng ea X-gal.Mehele e meraro ka ho fetisisa ea caudal cartilage e ile ea tlosoa ho etsa bonnete ba hore tšenyo leha e le efe ea mochine kapa ho boloka metsi ka lebaka la ho behoa ha tube ea endotracheal e ke ke ea kenngoa tlhahlobisong.Trachea e 'ngoe le e 'ngoe e ile ea khaoloa ka bolelele ho fumana lihalofo tse peli bakeng sa tlhahlobo 'me ea kenngoa ka kopi e nang le rabara ea silicone (Sylgard, Dow Inc) ho sebelisoa nale ea Minutien (Fine Science Tools) ho bona bokaholimo ba leseli.Kabo le sebopeho sa lisele tse fetotsoeng li netefalitsoe ke ho nka lifoto ka pele ho sebelisoa maekorosekopo ea Nikon (SMZ1500) ka khamera ea DigiLite le software ea TCapture (Tucsen Photonics, China).Litšoantšo li ile tsa fumanoa ka 20x magnification (ho kenyeletsoa boemo bo phahameng ka ho fetisisa bakeng sa bophara bo feletseng ba trachea), ka bolelele bohle ba trachea bo bontšitsoeng mohato ka mohato, ho fana ka ho kopana ho lekaneng pakeng tsa setšoantšo ka seng ho lumella litšoantšo hore li "roke".Litšoantšo tse tsoang trachea e 'ngoe le e' ngoe li ile tsa kopanngoa hore e be setšoantšo se le seng sa motsoako ho sebelisoa mofuta oa Composite Image Editor 2.0.3 (Microsoft Research) ho sebelisa algorithm ea planar motion. Sebaka sa polelo ea LacZ ka har'a litšoantšo tse entsoeng ka tracheal ho tsoa ho phoofolo e 'ngoe le e' ngoe li ile tsa lekanyetsoa ka ho sebelisa mongolo o ikemetseng oa MATLAB (R2020a, MathWorks) joalokaha ho hlalositsoe pele28, ho sebelisoa litlhophiso tsa 0.35 <Hue <0.58, Saturation> 0.15, le Value <0.7. Sebaka sa polelo ea LacZ ka har'a litšoantšo tse entsoeng ka tracheal ho tsoa ho phoofolo e 'ngoe le e' ngoe li ile tsa lekanngoa ho sebelisoa mongolo o ikemetseng oa MATLAB (R2020a, MathWorks) joalo ka ha ho hlalositsoe pele28, ho sebelisoa litlhophiso tsa 0.35 <Hue <0.58, Saturation> 0.15, le Value <0.7. Площадь экспрессии LacZ в составных изображениях трахеи от каждого животного была количественно определена с использованием автоматизированного сценария MATLAB (R2020a, MathWorks), как описано ранее28, с использованием настроек 0,35 <оттенок <0,58, насыщенность> 0,15 и значение <0 ,7. Sebaka sa polelo ea LacZ litšoantšong tse kopaneng tsa tracheal ho tsoa ho phoofolo e 'ngoe le e' ngoe e ile ea lekanngoa ho sebelisoa mongolo o ikemetseng oa MATLAB (R2020a, MathWorks) joalo ka ha ho hlalositsoe pejana28 ho sebelisoa litlhophiso tsa 0.350.15 le boleng<0 .7.如 前所前所, 自动 自动 Malab 脚本 (R2020A, maths 的 气管 来自来自 的 的 图像 图像 图像 中 中 中 中 中 中 中, 复合 0.58 <的 前所 自动 Malab 脚本 脚本 的 脚本 的 复合 每 的 复合 每 每 的 的 每 的 的 的 的 的 的 的 的只 的 的 每 每 的 的只 的 的 每 每 图像 的来自 的 的 每 每 图像 的只 的 复合 每................... Области экспрессии LacZ на составных изображениях трахеи каждого животного количественно определяли с использованием автоматизированного сценария MATLAB (R2020a, MathWorks), как описано ранее, с использованием настроек 0,35 <оттенок <0,58, насыщенность> 0,15 и значение <0,7 . Libaka tsa polelo ea LacZ litšoantšong tse kopaneng tsa trachea ea phoofolo e 'ngoe le e' ngoe li ile tsa lekanyetsoa ho sebelisoa mongolo o ikemetseng oa MATLAB (R2020a, MathWorks) joalo ka ha ho hlalositsoe pejana ho sebelisoa litlhophiso tsa 0.35 <hue <0.58, saturation> 0.15 le boleng <0.7.Ka ho latela li-contours tsa lithane ho GIMP v2.10.24, mask e ile ea etsoa ka letsoho bakeng sa setšoantšo se seng le se seng sa motsoako ho khetholla sebaka sa linama le ho thibela ho fumanoa leha e le efe ea bohata ka ntle ho lesela la tracheal.Libaka tse silafetseng tse tsoang litšoantšong tsohle tse entsoeng ka likarolo tse ngata tsa phoofolo e 'ngoe le e 'ngoe li ile tsa akaretsoa ho fana ka sebaka se nang le litšila bakeng sa phoofolo eo.Sebaka se pentiloeng se ile sa aroloa ke sebaka sohle sa mask ho fumana sebaka se tloaelehileng.
Trachea e 'ngoe le e' ngoe e ne e kentsoe ka parafine 'me e arotsoe ka 5 µm botenya.Likarolo li ile tsa haneloa ka bofubelu bo sa jeleng paate ka metsotso e 5 'me litšoantšo li ile tsa fumanoa ho sebelisoa microscope ea Nikon Eclipse E400, khamera ea DS-Fi3 le software ea NIS ea ho hapa lintlha (version 5.20.00).
Litlhahlobo tsohle tsa lipalo li entsoe ho GraphPad Prism v9 (GraphPad Software, Inc.).Bohlokoa ba lipalo-palo bo behiloe ho p ≤ 0.05.Tloaelo e ile ea lekoa ho sebelisoa tlhahlobo ea Shapiro-Wilk mme liphapang tsa ho silafatsa LacZ li ile tsa hlahlojoa ho sebelisoa tlhahlobo ea t e sa sebetseng.
Maparamente a tšeletseng a hlalositsoeng ho Lethathamo la 1 a ile a hlahlojoa ke PCXI, 'me ponahalo e hlalositsoe ho Lethathamo la 2. Li-MP1 tse peli tsa polystyrene (MP1 le MP2; 18 µm le 0.25 µm, ka ho latellana) li ne li sa bonahale ke PCXI, empa lisampole tse setseng li ne li ka tsejoa. (mehlala e bontšoa ho Setšoantšo sa 5).MP3 le MP4 li bonahala li fokola (10-15% Fe3O4; 0.25 µm le 0.9 µm, ka ho latellana).Le hoja MP5 (98% Fe3O4; 0.25 µm) e ne e na le likaroloana tse nyenyane ka ho fetisisa tse lekiloeng, e ne e le eona e hlakileng ka ho fetisisa.Ho thata ho khetholla sehlahisoa sa CombiMag MP6.Maemong 'ohle, bokhoni ba rona ba ho lemoha li-MF bo ile ba ntlafatsoa haholo ka ho tsamaisa makenete ka morao le pele e bapisa le capillary.Ha makenete a tloha ho capillary, likaroloana li ne li ntšoa ka liketane tse telele, empa ha limakete li atamela 'me matla a matla a khoheli a eketseha, liketane tsa likaroloana li ile tsa khutsufala ha likaroloana li fallela karolong e ka holimo ea capillary (bona Supplemental Video S1 : MP4), ho eketsa bongata ba likaroloana holimo.Ka lehlakoreng le leng, ha makenete e tlosoa ka har'a capillary, matla a tšimo a fokotseha 'me litho tsa MPs li hlophisa bocha ka liketane tse telele tse tlohang holimo holimo ho capillary (bona Supplementary Video S2: MP4).Ka mor'a hore makenete e khaotse ho tsamaea, likaroloana li tsoela pele ho tsamaea nako e itseng ka mor'a hore li fihle boemong ba ho lekana.Ha MP e ntse e atamela le hole le bokaholimo ba capillary, likaroloana tsa makenete li na le ho hula lithōle ka mokelikeli.
Ponahalo ea MP tlasa PCXI e fapana haholo lipakeng tsa lisampole.(a) MP3, (b) MP4, (c) MP5 le (d) MP6.Litšoantšo tsohle tse bontšitsoeng mona li nkuoe ka makenete e behiloeng hoo e ka bang 10 mm ka holim'a capillary.Li-circles tse bonahalang tse kholo ke li-bubble tsa moea tse qabeletsoeng ka har'a li-capillaries, tse bontšang ka ho hlaka likarolo tse ntšo le tse tšoeu tsa bohale ba setšoantšo sa phapano ea mohato.Lebokose le khubelu le bontša kholo e ntlafatsang phapang.Hlokomela hore li-diameter tsa li-circuits tsa makenete lipalong tsohle ha lia lokela ho lekanngoa 'me li batla li le kholoanyane ka makhetlo a 100 ho feta kamoo ho bontšitsoeng.
Ha makenete e tsamaea ka ho le letšehali le ka ho le letona karolong e ka holimo ea capillary, angle ea khoele ea MP e fetoha hore e ikamahanye le makenete (sheba setšoantšo sa 6), kahoo e hlalosa melapo ea matla a khoheli.Bakeng sa MP3-5, ka mor'a hore chord e fihle sekhutlong sa monyako, likaroloana li hula ka holim'a karolo e ka holimo ea capillary.Hangata sena se fella ka hore Maparamente a kopane ka lihlopha tse kholoanyane haufi le moo matla a khoheli a leng matla haholo (sheba Supplementary Video S3: MP5).Sena se bonahala haholo-holo ha ho nka litšoantšo haufi le qetellong ea capillary, e leng se etsang hore MP e ikopanye le ho tsepamisa mohopolo ho sebopeho sa moea sa mokelikeli.Likaroloana tse ho MP6, tse neng li le thata ho li khetholla ho feta tse ho MP3-5, ha lia ka tsa hula ha makenete e tsamaea ka capillary, empa likhoele tsa MP li ile tsa arohana, tsa siea likaroloana ponong (sheba Supplementary Video S4: MP6).Maemong a mang, ha matla a khoheli a sebelisitsoeng a fokotsehile ka ho tsamaisa makenete sebaka se selelele ho tloha sebakeng sa litšoantšo, Maparamente afe kapa afe a setseng a ne a theohela butle-butle tlase holim'a tube ka matla a khoheli, a sala khoeleng (sheba Supplementary Video S5: MP3) .
Lehlakore la khoele ea MP le fetoha ha makenete e leba letsohong le letona ka holim'a capillary.(a) MP3, (b) MP4, (c) MP5 le (d) MP6.Lebokose le khubelu le bontša kholo e ntlafatsang phapang.Ka kopo hlokomela hore livideo tse eketsehileng ke tsa merero ea tlhahisoleseding kaha li senola sebopeho sa bohlokoa sa likaroloana le boitsebiso bo matla bo ke keng ba bonoa litšoantšong tsena tse tsitsitseng.
Liteko tsa rona li bonts'itse hore ho tsamaisa makenete ho ea pele butle butle ho trachea ho nolofatsa pono ea MF maemong a motsamao o rarahaneng oa vivo.Ha ho na liteko tsa in vivo tse entsoeng hobane lifaha tsa polystyrene (MP1 le MP2) li ne li sa bonahale ka har'a capillary.E 'ngoe le e' ngoe ea li-MF tse 'nè tse setseng e ile ea lekoa ka vivo ka axis e telele ea makenete e behiloe holim'a trachea ka lehlakoreng la hoo e ka bang 30 ° ho ea holimo (sheba Lipalo 2b le 3a), kaha sena se ile sa fella ka liketane tse telele tsa MF 'me tsa atleha haholoanyane. hofeta makenete..tlhophiso e felisitsoe.MP3, MP4 le MP6 ha li so fumanehe ka har'a trachea ea liphoofolo life kapa life tse phelang.Ha u bona mokhoa oa ho phefumoloha oa likhoto ka mor'a ho bolaea liphoofolo ka botho, likaroloana li ile tsa lula li sa bonahale le ha molumo o eketsehileng o eketsoa ho sebelisoa pompo ea syringe.MP5 e ne e na le oxide e phahameng ka ho fetisisa ea tšepe 'me e ne e le eona feela karoloana e bonahalang, kahoo e ne e sebelisetsoa ho hlahloba le ho khetholla boitšoaro ba MP ka har'a vivo.
Ho behoa ha makenete holim'a trachea nakong ea ho kenngoa ha MF ho ile ha fella ka hore li-MF tse ngata, empa eseng kaofela, li tsepamise maikutlo tšimong ea pono.Ho kena ha tracheal ea likaroloana ho bonoa hantle ho liphoofolo tse bolailoeng ka botho.Setšoantšo sa 7 le Supplementary Video S6: MP5 e bonts'a ho tšoara matla a khoheli ka potlako le ho lumellana ha likaroloana holim'a trachea ea ventral, e bontšang hore li-MP li ka lebisoa libakeng tse lakatsehang tsa trachea.Ha ho batloa ka thōko ho trachea ka mor'a ho fana ka MF, li-MF tse ling li ile tsa fumanoa haufi le carina, e bontšang matla a sa lekaneng a matla a khoheli a ho bokella le ho tšoara li-MF kaofela, kaha li ne li fanoa ka sebaka sa matla a maholo a khoheli nakong ea tsamaiso ea mokelikeli.tshebetso.Leha ho le joalo, maikutlo a MP ka mor'a ho pepa a ne a phahame ho potoloha sebaka sa setšoantšo, ho fana ka maikutlo a hore litho tsa MP tse ngata li ntse li le libakeng tsa moea moo matla a khoheli a sebelisitsoeng a neng a le holimo haholo.
Litšoantšo tsa (a) pele le (b) ka mor'a ho tlisoa ha MP5 ka trachea ea rat e sa tsoa bolaoa e nang le makenete e behiloeng ka holim'a sebaka sa litšoantšo.Sebaka se tšoantšitsoeng se pakeng tsa mehele e 'meli ea lefufuru.Ho na le mokelikeli litseleng tsa moea pele MP e tlisoa.Lebokose le khubelu le bontša kholo e ntlafatsang phapang.Litšoantšo tsena li nkuoe videong e hlahang ho S6: MP5 Supplementary Video.
Ho tsamaisa makenete haufi le trachea ka vivo ho ile ha fella ka phetoho ea angle ea ketane ea MP sebakeng sa moea, se ts'oanang le se bonoang ka li-capillaries (sheba Figure 8 le Supplementary Video S7: MP5).Leha ho le joalo, thutong ea rona, litho tsa MP li ne li ke ke tsa huleloa holim'a lipampitšana tse phelang tsa phefumoloho, joalo ka ha li-capillaries li ka etsa.Maemong a mang, ketane ea MP ea lelefala ha makenete e tsamaea ka ho le letšehali le ka ho le letona.Hoa thahasellisa hore re fumane hape hore ketane ea likaroloana e fetola botebo ba lera la bokaholimo ba mokelikeli ha makenete e tsamaisoa ka nako e telele ka har'a trachea, 'me ea atoloha ha makenete e tsamaisoa ka ho toba holimo' me ketane e potoloha ho ea sebakeng se otlolohileng (bona Video ea Tlatsetso S7).: MP5 ka 0:09, tlase ka ho le letona).Sebopeho sa sebopeho sa motsamao se ile sa fetoha ha makenete e ne e suthisoa ka lehlakore holim'a trachea (ke hore, ka ho le letšehali kapa ka ho le letona la phoofolo, ho e-na le bolelele ba trachea).Likaroloana li ne li ntse li bonahala ka ho hlaka nakong ea ho tsamaea ha tsona, empa ha makenete e tlosoa trachea, lintlha tsa likhoele tsa likaroloana li ile tsa bonahala (sheba Supplementary Video S8: MP5, ho qala ka 0:08).Sena se lumellana le boitšoaro bo hlokometsoeng ba matla a khoheli tlas'a ketso ea matla a khoheli a sebelisitsoeng ka har'a capillary ea khalase.
Mehlala ea litšoantšo tse bontšang MP5 ka har'a trachea ea rat e hlabosang e phelang.(a) Makenete e sebelisoa ho fumana litšoantšo ka holimo le ka ho le letšehali la trachea, ebe (b) ka mor'a ho tsamaisa makenete ka ho le letona.Lebokose le khubelu le bontša kholo e ntlafatsang phapang.Litšoantšo tsena li tsoa videong e hlahang ho S7′s Supplementary Video: MP5.
Ha lipalo tse peli li ne li shebiloe ka lehlakoreng le ka leboea-boroa ka holimo le ka tlas'a trachea (ke hore, ho hohela; Setšoantšo sa 3b), likhetho tsa MP li ne li hlaha nako e telele 'me li ne li le leboteng la lateral la trachea ho e-na le holim'a mokokotlo oa mokokotlo. trachea (sheba Sehlomathiso).Video S9:MP5).Leha ho le joalo, likarolo tse phahameng tsa likaroloana sebakeng se le seng (ke hore, bokaholimo ba mokokotlo oa trachea) ha boa ka ba fumanoa ka mor'a tsamaiso ea mokelikeli o sebelisang mochine o mabeli oa makenete, oo hangata o hlahang ka mochine o le mong oa makenete.Joale, ha makenete e le 'ngoe e lokiselitsoe ho leleka lipalo tse fapaneng (Setšoantšo sa 3c), palo ea likaroloana tse bonahalang tšimong ea pono ha ea ka ea eketseha ka mor'a ho pepa.Ho theha li-contactations tse peli tsa makenete ho thata ka lebaka la matla a maholo a khoheli a hohelang kapa a sututsang limakete ka ho latellana.Setupo se ile sa fetoloa hore e be makenete a le mong a tsamaisanang le moea empa a feta moeeng ka lebelo la 90 degree e le hore mela ea matla e tšele lebota la tracheal orthogonally (Figure 3d), mokhoa o reretsoeng ho fumana monyetla oa ho kopanya likaroloana lebota la lateral.hlokomeloa.Leha ho le joalo, tlhophisong ena, ho ne ho se na motsamao o tsejoang oa ho bokella MF kapa motsamao oa makenete.Ho ipapisitsoe le liphetho tsena kaofela, ho ile ha khethoa tlhophiso e nang le makenete a le mong le mokhoa oa 30-degree bakeng sa lithuto tsa vivo tsa bajari ba liphatsa tsa lefutso (setšoantšo sa 3a).
Ha phoofolo e ne e etsoa setšoantšo ka makhetlo a mangata hang ka mor'a ho etsoa sehlabelo ka botho, ho se be teng ha motsamao oa linama o sitisang ho ne ho bolela hore mela e metle, e mekhutšoanyane ea likaroloana e ka hlokomeloa tšimong e hlakileng ea "intercartilaginous", 'ho sisinyeha' ho latela motsamao oa phetolelo oa makenete.bona ka ho hlaka boteng le motsamao oa likaroloana tsa MP6.
Karolo ea LV-LacZ e ne e le 1.8 x 108 IU/mL, 'me ka mor'a ho kopanya 1: 1 le CombiMag MP (MP6), liphoofolo li ne li kenngoa ka 50 µl ea tracheal dose ea 9 x 107 IU / ml ea koloi ea LV (ke hore 4.5 x 106 TU/rat).)).Lithutong tsena, ho e-na le ho tsamaisa makenete nakong ea mosebetsi, re ile ra beha makenete sebakeng se le seng ho bona hore na phetisetso ea LV e ka (a) ea ntlafatsoa ha e bapisoa le phano ea vector ha ho se na matla a khoheli, le (b) haeba tsela ea moea e ka khona. tsepamisa maikutlo.Lisele tse ntseng li fetisetsoa libakeng tse shebiloeng tsa makenete tsa pampitšana e kaholimo ea phefumoloho.
Ho ba teng ha makenete le ts'ebeliso ea CombiMag hammoho le li-vector tsa LV ha lia ka tsa bonahala li ama bophelo ba liphoofolo hampe, joalo ka protocol ea rona e tloaelehileng ea ho fana ka li-vector tsa LV.Litšoantšo tse ka pele tsa sebaka sa tracheal se tlas'a ho ferekanngoa ha mechine (Supplementary Fig. 1) e bontšitse hore sehlopha sa phekolo ea LV-MP se ne se e-na le maemo a phahameng haholo a transduction ka pel'a makenete (Fig. 9a).Ke palo e nyane feela ea botala ba LacZ e putsoa e neng e le teng sehlopheng sa taolo (Setšoantšo sa 9b).Quantification ea libaka tse tloaelehileng tsa X-Gal-stained normalized e bontšitse hore tsamaiso ea LV-MP ka boteng ba matla a khoheli e entse hore ho be le ntlafatso ea makhetlo a ka bang 6 (Setšoantšo sa 9c).
Mohlala oa litšoantšo tse kopaneng tse bonts'ang transduction ea tracheal ka LV-MP (a) boteng ba matla a khoheli le (b) ha makenete e le sieo.(c) Ntlafatso ea lipalo-palo sebakeng se tloaelehileng sa phetisetso ea LacZ ka trachea ka ts'ebeliso ea makenete (* p = 0.029, t-test, n = 3 ka sehlopha, ho bolela ± phoso e tloaelehileng ea moelelo).
Likarolo tse sa jeleng paate tse bofubelu tse sa jeleng paate (mohlala o bontšitsoeng ho Supplementary Fig. 2) li bontšitse hore lisele tse nang le LacZ-stained li ne li le teng ka sampuli e le 'ngoe le sebakeng se tšoanang le se tlalehiloeng pele.
Phephetso e ka sehloohong ea phekolo ea liphatsa tsa lefutso ea moea e ntse e le sebaka se nepahetseng sa likaroloana tsa lipalangoang libakeng tse thahasellisang le ho finyella boemo bo phahameng ba ho sebetsa hantle ka har'a matšoafo a selefouno ka pel'a ho phalla ha moea le ho tlosoa ha mucus ka mafolofolo.Bakeng sa bajari ba LV ba reretsoeng ho alafa mafu a phefumoloho ho cystic fibrosis, ho eketsa nako ea ho lula ha likaroloana tse tsamaisang moeeng ho fihlela joale e bile sepheo se ke keng sa finyelloa.Joalokaha Castellani et al., tšebeliso ea matla a khoheli ho ntlafatsa phetisetso e na le melemo ho feta mekhoa e meng ea phepelo ea liphatsa tsa lefutso joalo ka electroporation hobane e ka kopanya bonolo, moruo, phano ea lehae, ts'ebetso e eketsehileng, le nako e khuts'oane ea ho incubation.mme mohlomong le lethal dose le tlase la koloi10.Leha ho le joalo, in vivo deposition le boitšoaro ba likaroloana tsa makenete litseleng tsa moea tlas'a tšusumetso ea matla a khoheli a kantle ha ho mohla ho kileng ha hlalosoa, 'me ha e le hantle bokhoni ba mokhoa ona oa ho eketsa maemo a liphatsa tsa lefutso tseleng e phelang e sa fetoheng ha e so bontšoe ka har'a vivo.
Liteko tsa rona tsa in vitro ho PCXI synchrotron li bontšitse hore likaroloana tsohle tseo re li lekileng, ntle le MP polystyrene, li ne li bonahala ho setupong sa litšoantšo seo re se sebelisitseng.Ka pel'a matla a khoheli, matla a khoheli a theha likhoele, bolelele ba tsona bo amanang le mofuta oa likaroloana le matla a matla a khoheli (ke hore, ho atamela le ho tsamaea ha makenete).Joalo ka ha ho bonts'itsoe ho Setšoantšo sa 10, likhoele tseo re li bonang li thehoa ha karolo e 'ngoe le e' ngoe e ntse e hoheloa 'me e hohela matla a eona a khoheli a lehae.Likarolo tsena tse arohaneng li etsa hore likaroloana tse ling tse tšoanang li bokelle le ho hokahana le metsamao ea likhoele tsa sehlopha ka lebaka la matla a lehae a tsoang ho matla a sebaka sa ho hohela le ho nyenyefatsa likarolo tse ling.
Setšoantšo se bontšang (a, b) liketane tsa likaroloana tse hlahang ka hare ho li-capillaries tse tletseng mokelikeli le (c, d) trachea e tletseng moea.Hlokomela hore li-capillaries le trachea ha li huleloe ho sekaleng.Panel (a) e boetse e na le tlhaloso ea MF e nang le likaroloana tsa Fe3O4 tse hlophisitsoeng ka liketane.
Ha makenete a falla holim'a capillary, angle ea khoele ea likaroloana e fihlile moeling oa bohlokoa bakeng sa MP3-5 e nang le Fe3O4, ka mor'a moo khoele ea likaroloana ha e sa hlola e lula sebakeng sa eona sa pele, empa e ile ea fallela holim'a metsi ho ea sebakeng se secha.makenete.Phello ena e ka etsahala hobane bokaholimo ba khalase ea capillary bo boreleli bo lekaneng ho lumella motsamao ona hore o etsahale.Hoa thahasellisa hore MP6 (CombiMag) ha ea ka ea itšoara ka tsela ena, mohlomong hobane likaroloana li ne li le nyenyane, li e-na le seaparo se fapaneng kapa tefiso ea holim'a metsi, kapa mokelikeli oa thepa ea thepa o ile oa ama bokhoni ba bona ba ho sisinyeha.Phapang ea setšoantšo sa CombiMag le eona e fokola haholo, e fana ka maikutlo a hore mokelikeli le likaroloana li ka ba le letsoalo le ts'oanang, ka hona li ke ke tsa suthelana habonolo.Li-particle li ka boela tsa khomarela haeba makenete o tsamaea ka lebelo le leholo, ho bontša hore matla a khoheli a ke ke a hlola a khona ho hlola khohlano pakeng tsa likaroloana tsa mokelikeli, ho fana ka maikutlo a hore matla a khoheli le sebaka se pakeng tsa makenete le sebaka seo ho shebiloeng ho sona ha sea lokela ho tla joalo ka makatsa.bohlokoa.Liphetho tsena li boetse li bonts'a hore le hoja makenete a ka tšoara li-microparticles tse ngata tse phallang sebakeng seo ho shebiloeng ho sona, ha ho na monyetla oa hore limakete li ka tšeptjoa ho tsamaisa likaroloana tsa CombiMag holim'a trachea.Kahoo, re ile ra etsa qeto ea hore lithutong tsa vivo LV MF li lokela ho sebelisa matla a khoheli a tsitsitseng ho shebana le libaka tse itseng tsa sefate sa moea.
Hang ha likaroloana li fetisetsoa 'meleng, ho thata ho li khetholla ho latela moelelo oa lisele tse rarahaneng tse tsamaeang tsa' mele, empa bokhoni ba bona ba ho lemoha bo ntlafalitsoe ka ho tsamaisa makenete ka holimo holim'a trachea ho "tsosa" likhoele tsa MP.Le hoja litšoantšo tsa nako ea sebele li khoneha, ho bonolo ho lemoha motsamao oa likaroloana ka mor'a hore phoofolo e bolaoe ka botho.Maemo a MP hangata a ne a le holimo haholo sebakeng sena ha makenete e behiloe holim'a sebaka sa litšoantšo, leha likaroloana tse ling li ne li atisa ho fumanoa ho theosa le trachea.Ho fapana le lithuto tsa in vitro, likaroloana li ke ke tsa huleloa ho theosa le trachea ka motsamao oa makenete.Sengoliloeng sena se lumellana le tsela eo mucus e koahelang bokaholimo ba trachea ka tloaelo e sebetsanang le likaroloana tse huleloang, e li koahele ka har'a mucus ebe ka mor'a moo e li tlosa ka mochine oa ho hloekisoa ha muco-ciliary.
Re ile ra nahana hore ho sebelisa makenete ka holimo le ka tlase ho trachea bakeng sa ho hohela (setšoantšo sa 3b) ho ka fella ka matla a khoheli a ts'oanang a ts'oanang, ho e-na le matla a khoheli a matla haholo ka nako e le 'ngoe, e leng se ka etsang hore ho be le kabo e tšoanang ea likaroloana..Leha ho le joalo, thuto ea rona ea pele ha ea ka ea fumana bopaki bo hlakileng ba ho tšehetsa khopolo ena.Ka mokhoa o ts'oanang, ho beha para ea makenete hore e khutlisetse morao (setšoantšo sa 3c) ha sea ka sa etsa hore likaroloana tse ling li lule sebakeng sa setšoantšo.Liphuputso tsena tse peli li bonts'a hore ho seta ha makenete a mabeli ha ho ntlafatse taolo ea lehae ea MP e supang, le hore matla a matla a khoheli a hlahang ho thata ho a tsamaisa, a etsa hore mokhoa ona o seke oa sebetsa.Ka ho tšoanang, ho tsamaisa makenete ka holimo le ho pholletsa le trachea (Setšoantšo sa 3d) le sona ha sea ka sa eketsa palo ea likaroloana tse setseng sebakeng sa setšoantšo.Tse ling tsa litlhophiso tsena li kanna tsa se atlehe kaha li baka phokotso ea matla a matla a khoheli sebakeng sa deposition.Ka hona, tlhophiso ea makenete e le 'ngoe ka likhato tse 30 (setšoantšo sa 3a) se nkoa e le mokhoa o bonolo le o sebetsang ka ho fetisisa oa ho hlahloba vivo.
Phuputso ea LV-MP e bontšitse hore ha li-vector tsa LV li kopantsoe le CombiMag 'me li fanoa ka mor'a ho khathatseha 'meleng ka pel'a matla a khoheli, maemo a phetisetso a ile a eketseha haholo ka trachea ha a bapisoa le taolo.Ho itšetlehile ka lithuto tsa litšoantšo tsa synchrotron le liphello tsa LacZ, matla a khoheli a bonahala a khona ho boloka LV ka har'a trachea le ho fokotsa palo ea likaroloana tsa vector tse ileng tsa kenella hang-hang ka har'a matšoafo.Lintlafatso tse joalo tsa sepheo li ka lebisa ts'ebetsong e phahameng ha li ntse li fokotsa li-titer tse fanoeng, phetisetso e sa lebelloang, litlamorao tsa ho ruruha le ho itšireletsa mafung, le litšenyehelo tsa phetisetso ea liphatsa tsa lefutso.Habohlokoa, ho ea ka moetsi, CombiMag e ka sebelisoa hammoho le mekhoa e meng ea ho fetisetsa liphatsa tsa lefutso, ho kenyelletsa le likokoana-hloko tse ling tsa kokoana-hloko (tse kang AAV) le nucleic acid.